实验步骤主要参照 United state Biochemica(USB)sequene Version 2.0 T7 DNA polymerase sequencing protocol 进行。实验进行分二部份。第一部份变性双股DNA 的制备与第二部份双去氧核醣核酸终止法反应的进行。

 

第一部份变性双股 DNA 的制备

 

取2μg的双股 DNA ，加去离子水至 18μL后，加入2μL denature solution (2N NaOH and 2mM EDTA) ，至于室温5分钟，加入2μL2M ammonium acetate 和75μL 70% 酒精，置于冰上 10 分钟。再以10000rpm离心 10 分钟，去除上清液。以 70% 酒精清洗一次。真空乾燥之后，以6μL去离子水溶解。

 

第二部份双去氧核醣核酸终止法反应

 

将第一部份所进行完成的反应，加入2μL sequencing primer (5 pmol) 和2μL sequencing buffer，置于 37℃ 15 分钟后，加入1μL DTT，2μL 1X labelling mixture, 1μL (a -35S) dATP 及2μL (稀释 1:8) SequenaseTM (Bacteriophage T7 DNA polymerase)，置于室温 5 分钟。 5 分钟后，取 3.5μL 分别加至已先预热37℃， 2.5μL的 ddATP ， ddTTP ， ddCTP和ddGTP的管中，均匀混和后，置于 37℃反应5分钟后，各加入4μL的 stop solution 终止反应，置于 -20℃ 保存至凝胶电泳进行时。

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