杂合反应 (hybridization)

一杂合 (hybridization):

1. transferred并于80℃定温箱中固定DNA后，将 Nylon membrane放置于封口袋中加入2 ml hybridization buffer，置于圆锥瓶42 ℃下30分钟，

并以20 rpm旋转，使液体可均匀接触到尼龙膜。【prehybridization】

2. 于prehybridization 同时，先将欲加入之probe以沸水煮5 min，再置于冰上5 min。

3. 分别加入5μl probe，于42 ℃下， 20 rpm 旋转隔夜。

4. 以10 ml含0.1 % SDS之2X SSC buffer在室温下(25 ℃)洗两次，

每次15分钟。

【Buffer 的配制: 50μl 20 % SDS + 10 ml 20X SSC 再加Q水至10 ml】

5. 以100ml 0.1% SDS之0.1X SSC buffer 于68 ℃下洗两次，每次15分钟。

【Buffer 的配制: 50μl 20 % SDS + 50μl 20X SSC 再加Q水至10 ml】

二 NBT/BCIP呈色

1.首先将hybridization后之尼龙膜置于 10 ml washing buffer 1-5分钟。

2.于10 ml Buffer II中行 blocking，作用30分钟。

3.旋置于10 ml Antibody-Enzyme conjugate solution ( 1μl anti-DIG-AP 混合10 ml Buffer II )中作用30分钟。

4.分别用10 ml washing buffer 洗两次，每次15分钟

5.浸渍于10 ml detection buffer ( Buffer III )中2-5分钟。

6.加入呈色剂【100μl NBT/BCIP stock solution + 5 ml Buffer III】，放置于抽屉中反应。

7.作用10-30 min后，加入20ml RO水，清洗两次。

8.清洗后之尼龙膜置于擦手纸上晾乾，再移至新的封口袋中避光保存。

Buffer I：0.1M maleic acid 23.2 g

0.15 M NaCl 17.53g / 2L。调至pH 7.5。

Washing buffer：Buffer I + 3% tween 20 (v/v)。

【900μl tween 20 + 30 ml Buffer I】

Buffer II：Blocking stock solution 加入 Buffer I中使 Blocking reagent

浓度为1 %。【2 ml 10X Blocking stock solution + 18 ml Buffer I】

Buffer III： 0.1M Tris-HCl

0.1M NaCl 0.5844g 再加10ml 0.1M Tris-HCl

0.05 M MgCl₂ 1.0165g 配成90ml

将 pH 调至9.5。

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